Dynamics and Mechanism of DNA-Bending Proteins in Binding Site Recognition

این مطالعه با استفاده از یک رویکرد جدید که وضوح زمانی بالای تکنیک لیزر T-jump را با مجموعه‌های منحصربه‌فرد کاوشگرهای فلورسنت ترکیب می‌کند، دینامیک DNA حل‌نشده قبلی را در طول جستجو و شناسایی توسط یک پروتئین خمشی DNA معماری و دو آسیب DNA نشان می‌دهد. پروتئین های تشخیص

بسیاری از فرآیندهای سلولی شامل پروتئین های خاصی هستند که با میل ترکیبی بالا به مکان های DNA خاصی متصل می شوند. اینکه چگونه این پروتئین‌ها مکان‌های خود را شناسایی می‌کنند در حالی که به سرعت در میان 3 میلیارد مکان غیر اختصاصی در DNA ژنومی جستجو می‌کنند، همچنان یک معمای برجسته است. مطالعات ساختاری نشان می‌دهد که پروتئین‌ها به شدت DNA را در مکان‌های خاص تغییر شکل می‌دهند و نشان می‌دهند که تغییر شکل‌پذیری DNA یک عامل کلیدی در تشخیص مکان خاص است. با این حال، تشخیص پویایی تغییر شکل‌های DNA دشوار بوده است، بنابراین درک ما از مکانیسم‌های تشخیص را پنهان می‌کند.

آزمایش‌های ارائه‌شده در این پایان‌نامه، برای اولین بار، باز شدن/خم شدن سریع DNA (حدود 100 تا 500 میکروثانیه) را نشان می‌دهد که به بازجویی غیراختصاصی نسبت داده می‌شود، قبل از پیچیدگی (5-50 میلی‌ثانیه) کندتر DNA/ خم شدن / چرخاندن نوکلئوتید در طول تشخیص. این نتایج کمک می‌کند تا روشن شود که چگونه یک پروتئین جستجوگر تغییر شکل‌پذیری DNA را بررسی می‌کند و در نهایت به محل هدف خود برخورد می‌کند. بازجویی زیر میلی‌ثانیه‌ای ممکن است باعث توقف ترجیحی پروتئینی که سریعاً اسکن می‌شود در سایت‌های هم خانواده را افزایش دهد، بنابراین تشخیص مکان را ممکن می‌سازد. چنین فرآیندهای جستجو-بازجویی-شناخت چند مرحله‌ای از طریق تغییرات ساختاری پویا ممکن است در مکانیسم‌های تشخیص پروتئین‌های مختلف متصل شونده به DNA مشترک باشد.

Using a novel approach that combines high temporal resolution of the laser T-jump technique with unique sets of fluorescent probes, this study unveils previously unresolved DNA dynamics during search and recognition by an architectural DNA bending protein and two DNA damage recognition proteins.

Many cellular processes involve special proteins that bind to specific DNA sites with high affinity. How these proteins recognize their sites while rapidly searching amidst ~3 billion nonspecific sites in genomic DNA remains an outstanding puzzle. Structural studies show that proteins severely deform DNA at specific sites and indicate that DNA deformability is a key factor in site-specific recognition. However, the dynamics of DNA deformations have been difficult to capture, thus obscuring our understanding of recognition mechanisms.

The experiments presented in this thesis uncover, for the first time, rapid (~100-500 microseconds) DNA unwinding/bending attributed to nonspecific interrogation, prior to slower (~5-50 milliseconds) DNA kinking/bending/nucleotide-flipping during recognition. These results help illuminate how a searching protein interrogates DNA deformability and eventually “stumbles” upon its target site. Submillisecond interrogation may promote preferential stalling of the rapidly scanning protein at cognate sites, thus enabling site-recognition. Such multi-step search-interrogation-recognition processes through dynamic conformational changes may well be common to the recognition mechanisms for diverse DNA-binding proteins.